МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ, ВЫБОР МОДЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ И МАТЕРИАЛЫ


В работе нами использовались достаточно распространенные и хорошо апробированные методы и подходы для проведения комплексного эколого-генетического анализа. В первую очередь необходимо было оценить экологическую составляющую, касающуюся определения степени радиоактивного загрязнения территорий, находящихся в зоне возможного влияния Тоцкого радиоактивного следа и за его пределами. Проведен анализ содержания основных радионуклидов в водных и наземных экосистемах в почвенном профиле, растениях и некоторых индикаторных видах животных. Параллельно на тех же объектах сделан химический анализ, позволяющий оценить содержание некоторых тяжелых металлов. Второе направление исследований позволяло приблизиться к оценке генетической компоненты нарушений, опираясь на традиционный цитогенетический анализ характерных повреждений генома в клетках костного мозга модельных индикаторных видов млекопитающих. Третий аспект исследований дает возможность оценить характер и выраженность морфогенетических нарушений, приводящих к врожденным аномалиям развития и уродствам, а также выявить возможные отдаленные эколого-генетические последствия взрыва на модельных популяциях вида-радиофора рыжей полевки (Clethrionomys glareolus Schreb.) и синантропной домовой мыши (Mus musculus L.), рассматривая их как экотоксикологическую модель ожидаемых нарушений развития, приводящих к появлению уродств в будущей аборигенной популяции людей в зоне ТРАС. Четвертое направление работ связано с проведением ретроспективной ЭПР-дозиметрии одонтологических структур, в частности эмали зубов, у очевидцев Тоцкого взрыва. Это позволяет уточнить величину поглощенных доз, полученных местным населением и войсками в момент испытаний ядерного оружия.

Сочетание всех этих подходов и методов с уже известными медико-экологическими фактами, собранными сотрудниками ОГМА и других медицинских учреждений страны под руководством проф. В.М. Боева, позволяют рассмотреть имеющуюся на сегодняшний момент общую картину возможных отдаленных последствий Тоцкого взрыва в Оренбургской области, определить нерешенные проблемы и наметить новые перспективы дальнейшей работы.

Для оценки степени радиоактивного загрязнения почвенного покрова природных экосистем выбирали сопряженные элементы рельефа, включающие в себя участки суши от водораздела до поймы реки или береговой линии водоема. Такой подход позволяет оценить пути миграции загрязнителей и места их депонирования. В пределах элювиального, транс-элювиального и аккумулятивного ландшафтов выбирались для исследования репрезентативные площадки (участки), где закладывались базовые разрезы и прикопки, позволяющие оценить варьирование свойств почвенного покрова. Проводили традиционное полевое морфологическое обследование почвы, отбирали образцы на лабораторные исследования по слоям по 10 см с привязкой к границам генетических горизонтов с учетом площади до глубины предполагаемой миграции радионуклидов. В местах расположения разрезов производили отбор представительных проб разнотравья.

Почвенные разрезы закладывались в одной или двух повторностях на каждом из обследуемых элементов рельефа. Всего было заложено 26 разрезов, из которых взято для определения радионуклидов 159 почвенных и 23 растительных образца.

Подготовка отобранных проб для анализа агрохимических свойств почв и определение содержания 90Sr, 137Cs, 238U, 232Th включала высушивание и просеивание образцов грунтов и почв, озоление растений. В подготовленных пробах определили содержание 90Sr радиохимически по дочернему 90Y, радиометрию осадков которого проводили на малофоновой установке УМФ-1500 с торцовым счетчиком СБТ-16 при ошибке счета не более 15 %. 238U и 232Th определяли фотоколориметрически с реактивом арсеназо-III, а содержание 137Cs на многоканальном g -анализаторе типа АИ-256-6 с кристаллом NaJ, активированным Tl при ошибке счета не более 30 %. По договоренности с Белоярской АЭС им. И.В. Курчатова в пробах разнотравья было определено содержание 7Be. Идентификация энергетического пика бериллия производилась с помощью многоканального g -анализатора с полупроводниковым детектором.

Содержание плутония определяли радиохимическим методом (Павлоцкая и др. , 1984). Химический выход плутония определяли путем внесения в параллельную навеску, по массе равную анализируемым, до ее прокаливания известного количества 238Pu, 239Pu и 240Pu и выделения его в аналогичных условиях. Как показали определения, химический выход плутония варьировал в пределах 85-95%. Образцы плутония, выделенные на ядерных фильтрах, измеряли с помощью сцинтилляционного радиометра типа САС-Р-2 при ошибке счета, не превышающей 25%.

Места взятия проб показаны на карте-схеме (рис.3). В начале Тоцкого радиоактивного следа в радиоэкологическом отношении были обследованы районы населенных пунктов Маховка и Пронькино. Первая точка отбора проб (ТОП) располагалась в районе д. Маховка на берегу пруда, сооруженного в верховье небольшой реки, правого притока реки Самары, впадающей в нее ниже н.п. Тоцкое-2. Пруд существовал до взыва 1954 г. В момент взрыва д.Маховка, располагавшаяся на берегах пруда, полностью сгорела. Современная д. Маховка находится в стороне от прежней деревни. Место отбора проб почв и растений подобрано таким образом, чтобы перехватить сток со склонов возвышенности, обращенных к месту взрыва атомной бомбы. Почвенные разрезы приурочены к центральной части днища временного водотока, ведущего к пруду. В этой и последующих обследованных нами точках отобраны пробы почв и растений.

Рис. 3. Карта-схема расположения точек сбора радиоэкологических проб в наземных и водных экосистемах.

Вторая ТОП находится в 4-х км к северу от д.Маховка вблизи д. Пронькино. Почвенные разрезы заложены вблизи пруда, расположенного на правом притоке р. Малый Уран, на днище неширокого временного водотока.

Третья ТОП расположена недалеко от д. Кинзелька в районе водохранилища на реке Ольховке, правом притоке р. Малый Уран, впадающем в реку Самару. Водохранилище создано 10 лет назад. Вдоль правого берега реки расположена широкая пойма, к которой обращены северные склоны гряды. Почвенные разрезы заложены на плоско-выпуклом водоразделе и надпойменной террасе вблизи водохранилища.

Четвертая ТОП расположена около д. Грачевка в 7 км к югу от д. Яшкино. Почвенные разрезы заложены на правом берегу небольшой речки, впадающей в пруд, на месте ее старого русла.

Пятая ТОП находится в районе пос. Султакай. Почвенные разрезы заложены непосредственно на левом берегу реки и на склоне южной экспозиции ложбины временного водотока.

Шестая ТОП выбрана на левом берегу реки Неть, правом притоке реки Салмыш, впадающем в реку Сакмару, приток р.Урал. Место отбора проб находится в 4-х км к востоку от д. Рождественка. Почвенные разрезы заложены на левом берегу реки Неть на сильно задернованной пойме.

Седьмая ТОП выбрана вблизи юго-восточной оконечности Тоцкого полигона у д. Кирсановки в старице реки Сорочки, левого притока реки Самары. Эта точка находится в 17 км от места взрыва бомбы. Почвенный разрез заложен в долине левого притока реки Самары. Приурочен к днищу слабоврезанного временного водотока.

Восьмая ТОП расположена поблизости от н.п. Павлово-Антоновка в 30 км к югу от места взрыва. Почвенные разрезы заложены на излучине в пойме левого притока реки Самары. Эта точка рассматривалась в качестве условного контроля (КТ-1).

Девятая ТОП выбрана в районе н.п. Нижнекристалка в 50 км к северо-востоку от места взрыва. На левом берегу правого притока реки Ток в пойме и на площадке первой надпойменной террасы заложены почвенные разрезы. Точка рассматривалась в качестве контрольной (КТ-2).

Десятая ТОП находится вблизи д. Дмитриевка в верховьях реки Ток . Почвенные разрезы были заложены в долине в верховье реки Ток и характеризуют почвы, сформировавшиеся на высокой пойме и аккумулятивной первой надпойменной террасе. Данная точка также использовалась в качестве контрольной (КТ-3).

При радиоэкологическом изучении водных экосистем места отбора проб были приурочены к участкам радиоэкологического изучения почвенно-растительного покрова, проводившегося параллельно и одновременно в наземных экосистемах (рис.3). Поэтому на территории Оренбургской области были подобраны следующие 10 водоемов, в которых провели отбор проб воды, грунта и водных растений: 1 - пруд близ д. Маховки, на берегах которой она находилась до пожара, вызванного взрывом атомной бомбы (пруд находится на правом притоке р. Самары); 2 - пруд в районе д. Пронькино, находящейся в 4 км к северу от д. Маховки и расположенный на правом притоке р. Малый Уран, который впадает в р. Самару; 3 - водохранилище на р. Ольховке, правом притоке р. М.Уран, созданное в 1984 г. в 1 км от д. Кинзельки; 4 - район пруда, существовавшего на р. М.Уран близ д. Грачевки до 1954 г.; 5- участок русла правого притока р. Ток вблизи восточной окраины д. Султакай; 6 - р. Неть - приток р. Сакмары (бассейн р. Урал) - в 1,5 км к востоку от д. Рождественка; 7 - р. Сорочка (левый приток р. Самары) в районе д. Кирсановки; 8 - левый приток р. Самары вблизи с. Павлово-Антоновки; 9 - правый приток р. Ток вблизи д. Нижнекристалки ; 10 - верховье р. Ток возле д. Дмитриевка. Пункты отбора проб 8-10 избраны в качестве контрольных.

Пробы воды для определения в ней 90Sr и 137Cs отбирали в специальные емкости по 60 л в двух повторностях из разных частей каждого водоема и сразу подкисляли. Одновременно в тех же местах для определения соде-ржания брали по 2 л воды в двух повторностях, помещали в отдельные емкости, которые герметично закрывали.

Пробы донных отложений отбирали в каждом водоеме на трех прибрежных участках, удаленных друг от друга на 20-30 м с помощью специальных пробоотборников послойно (0-10, 10-20, 20-30 и т.д. см). В каждой пробе объединяли соответствующие слои 2-3 кернов для получения образца нужной массы. Сырая масса пробы грунта составляла 0,5-3 кг. Образцы донных отложений высушивали до воздушно-сухого состояния, растирали и просеивали через сито с диаметром ячеек 1 мм.

Отобранные для определения 90Sr и 137Cs пробы воды фильтровали, затем выпаривали и сухой остаток озоляли при температуре 450оС. Часть озоленого остатка использовали для определения содержания в воде радионуклидов, а часть - для анализов на содержание ряда химических элементов. Образцы воды, отобранные для определения трития, подвергали дистилляции и одноступенчатому электролитическому обогащению (Чиркова, 1974).

Пробы водных растений брали в трех повторностях по 2-3 кг сырой массы в каждой. Пробы водных растений отобраны во всех пунктах, кроме пункта 5 в правом притоке р. Ток возле д. Султакай, где водная растительность отсутствовала. Отмытые от загрязнений растения, высушивали до воздушно-сухого состояния и озоляли в муфельной печи при 450 оС.

Радиометрию зольных образцов воды и растений, а также образцов донных отложений проводили по той же методике, которая использовалась при анализе почв. Для измерения содержания в воде трития 1 мл обогащенной пробы смешивали с 10 мл сцинтилляционной жидкости ЖС-8 и стабилизировали. Полученный таким образом образец радиометрировали на сцинтилляционной счетной установке "Delta-300". Содержание радионуклида в пробе воды рассчитывали путем сравнения ее со стандартным образцом, содержащим заданное количество трития (чувствительность метода 10 Бк/л).

Определение содержания химических элементов в пробах воды, водных растений и грунтов проводили методом эмиссионного спектрального анализа с фотографической регистрацией спектра. Установка состояла из следующих блоков: спектограф дифракционный PGS (Carl Zeiss, Iena) с решеткой 651 штр/мм и двухлинзовой системой освещения; полуавтомат-приставка для непрерывной просыпки проб (AU-3); генератор "Резонанс", конструкция и изготовление ИГЕМ АН РФ (сила тока дуги 38А). Интенсивность спектральных линий оценивалась визуально по методу появления и усиления этих линий. При соответствии состава анализируемых проб и стандартных образцов относительная ошибка составляет около 30%. Для определения массовых долей химических элементов в пробе использовали аналитические линии и количественные признаки, согласно имеющимся рекомендациям. В воде было определено содержание 11 микроэлементов : Mn, Pb, Co, Ni, V, Сu, Zn, Sb, Ba, As, Fe, которое сопоставляли с ПДК по этим элементам, значения которых представлены соответственно: 0.1, 0.03, 0.01, 0.1, 0.1,1.0, 1.0, 0.05, 0.1, 0.05, 0.3 мг/л.

Как уже отмечалось выше, наряду с пробами почв и растений проводили изучение суммарной бета-активности и содержания 90Sr и 137Cs в тушках и костях животных: мелких млекопитающих. В настоящее время хорошо известно, что млекопитающие в целом значительно более радиочувствительны, чем многие другие группы животных. Мелкие млекопитающие, особенно грызуны, интенсивно изучаются радиобиологами, радиоэкологами и экотоксикологами (Dunaway, Kaye,1963; Ильенко, 1974; Исаев, 1975; Соколов, Ильенко, 1976; Исаев, Покаржевский, 1978; Абатуров, 1984; Безель, 1987; Криволуцкий и др.,1988; Ильенко, Крапивко,1993; Тестов,1993; Экологические последствия ..., 1993). Это и различные линии лабораторных мышей и крыс и природные модельные популяции грызунов, обитающие на исследовательских полигонах, подвергнутых радиоактивному загрязнению. Многочисленность этой группы животных, их широкая представленность в различных трофических цепях экосистем, возможность определенной экстраполяции результатов экотоксикологического анализа с этой группы млекопитающих на человека (Безель,1987) и то, что они прямо испытывают давление тех или иных негативных факторов среды на большой территории, позволяет широко использовать их для целей индикации нарушенности среды. Многие виды грызунов ведут строго оседлый и роющий образ жизни, что приводит к их постоянному обитанию на участках в условиях повышенного фона естественной или искусственной радиации. Это тоже делает мелких млекопитающих значительно более удобным обьектом для радиоэкологического мониторинга, чем при использовании подвижных форм.

Следует заметить, что как при остром, так и при умеренном хроническом воздействии радиации показана большая зависимость радиоэкологических эффектов от многих причин. Среди них, в первую очередь, следует выделить особенности экологии вида, приводящие к разной степени внешнего и внутреннего облучения, положение вида в трофической цепи, неодинаковую подвижность, ведущую к разным размерам территории обитания, а, следовательно, к разной величине концентрации радионуклидов в организме, наконец, различающиеся у разных видов механизмы клеточных и тканевых адаптаций к неблагоприятным факторам среды. Все это делает необходимым, во-первых, тщательный подбор индикаторных признаков и индикаторных, относительно радиочувствительных видов, а, во-вторых, долговременные, в течение ряда лет наблюдения за млекопитающими с использованием взаимодополняющих популяционно-экологических, морфофизиологических, цитогенетических и феногенетических методов, позволяющих действительно комплексно оценивать массовый материал.

Отлов грызунов и насекомоядных млекопитающих проводили с учетом двух аспектов: 1 - оценить данные по модельным видам, обитающим в естественных экосистемах, которые в наибольшей степени аккумулируют радионуклиды; 2 - получить сведения о видах в наибольшей степени приближенных к жилищам человека и населяющих агроценозы. Первый аспект сравнения представлен материалами по европейской рыжей полевке. Второй аспект исследований основан на материалах по восточноевропейской полевке и домовой мыши. Сравнительно недавно установлено, что некоторые грызуны и другие млекопитающие являются избирательными накопителями радионуклидов (90Sr,137Cs), то есть видами-радиофорами (Ильенко, Крапивко, 1993).

На территории , затронутой ТРАС в Оренбургской области, таким модельным видом-радиофором, в первую очередь, является европейская рыжая полевка (Clethrionomys glareolus Schreb., 1778). При смене поколений от 2 до 3 в год популяции рыжей полевки обитают на территории ТРАС в Оренбургской области в зонах с разной степенью радиоактивного загрязнения в течение, по крайней мере, 85-125 поколений с момента ядерного взрыва. Выбор этого вида как адекватной модели для проведения эколого-генетического мониторинга определен тем, что популяции рыжей полевки многочисленны (это один из самых многочисленных видов грызунов в области), приурочены к наиболее загрязненным радионуклидами пойменным лесным экосистемам и ведут оседлый и роющий образ жизни, т.е. длительно и прямо испытывают воздействие радиоактивного загрязнения на больших территориях, а сам вид хорошо изучен в радиоэкологическом и популяционно-экологическом отношении (Большаков, Васильев, 1975; Васильев, 1984; Европейская рыжая полевка, 1981; Ильенко, Крапивко,1989,1993). В трофическом отношении вид менее специализирован, чем другие и спектр его питания достаточно широк. Рыжая полевка питается зелеными частями растений, зернами, ягодами, грибами, а также различными почвенными беспозвоночными (Европейская рыжая полевка, 1981). Обитающие в Оренбургской области виды мышей (желтогорлая, уральская (прежнее название лесная) и полевая), населяющие природные экосистемы, в значительной степени являются семеноядными формами - "зерноядами". С другой стороны - грызуны открытых ландшафтов и агроценозов: обыкновенная, восточно-европейская и пашенная полевки - это достаточно выраженные "зеленояды", которые преимущественно питаются зелеными частями растений. Анализируя содержание радионуклидов и тяжелых металлов в организме рыжей полевки, питающейся более разнообразными кормами, можно более полно охарактеризовать степень загрязнения природных наземных экосистем техногенными поллютантами.

Синантропные домовые мыши (Mus musculus), обитающие рядом с человеком, являются адекватной моделью для выявления существующего в настоящее время мутагенного потенциала среды, поскольку в основновном подвергаются воздействию мутагенов за счет тех же источников, что и человек (воздух, вода, пища). Домовые мыши повсеместно многочисленны, что делает возможным изучение больших выборок, достаточных для выявления даже слабых эффектов с высокой достоверностью. Однако популяции домовых мышей не вполне автохтонны - они могут периодически пополняться за счет завоза зверьков из других регионов, что может регулярно вносить изменения в исторически сложившийся генофонд. Тем не менее, это же обстоятельство, позволяет рассматривать популяции данного вида как грубую экотоксикологическую модель популяции человека, которая также в значительной степени подвержена генетическому обмену.

Еще один объект мониторинга - восточноевропейская полевка (Microtus rossiaemeridionalis) - типичный обитатель агроценозов и открытых ландшафтов, включая сенокосы и пастбища. Эти территории исходно являются естественными экосистемами, но по большей части преобразуются под действием человеческой деятельности. Восточноевропейская полевка, аккумулируя в организме техногенные поллютанты на таких территориях, может служить хорошим индикатором их загрязнения, а также отражать мутагенный потенциал среды для агроландшафтов, которые служат источником получения сельскохозяйственной продукции.

Суммарная бета-активность и содержание 90Sr и 137Cs в организмах грызунов и насекомоядных были определены в лаборатории радиоэкологии ИЭРиЖ УрО РАН к.б.н. М.Г. Нифонтовой. Тушки животных с удаленными внутренними органами и черепом высушивали до воздушно-сухого состяния и озоляли при температуре 450° С. Интегральную бета-активность определяли индивидуально для каждого зверька (в 2-3 повторностях) радиометрией золы на универсальной малофоновой установке с торцовым счетчиком СБТ-13, а при анализе содержания 90Sr и 137Cs тушки животных были объединены для каждой выборки. Суммарную бета-активность расчитывали с эталонировкой по 90Sr. 90Sr определяли радиохимическим методом по дочернему 90Y с последующей радиометрией осадков на универсальной малофоновой установке; 137Cs определяли на гамма-спектрометре АИ-256-6 с кристаллом NaJ (Tl) размером 80х80 и колодцем 24х40 мм. Статистическая ошибка анализов не превышала 10-15 %. Определение бета-активности костной ткани (черепа зверьков, добытых в 1996 г. в эпицентральной зоне в пойме р.Лиман в 10 км от места взрыва), было проведено в лаборатории экотоксикологии д.б.н. Н.М. Любашевского. Известно, что бета-активность кости почти на 90% обусловлена активностью 90Sr.

Анализ уровней накопления тяжелых металлов в органах и тканях животных был проведен в лаборатории экодиагностики и нормирования ИЭРиЖ УрО РАН под руководством д.б.н. В.С.Безеля. После вскрытия печень, почки и очищенные от мышц кости задних конечностей отловленных зверьков высушивали до воздушно-сухого веса. В лабораторных условиях образцы подвергали мокрой минерализации с концентрированной азотной кислотой на водяной бане. После озоления методом атомно-абсорбционной спектрометрии определяли уровни накопления четырех тяжелых металлов - свинца, кадмия, меди и цинка в костной ткани, почках и печени зверьков (в мкг/г сухого веса). Всего в 1994 г. было проанализировано 304 пробы (106 экз. - скелета; 107 - почек; 91 - печени) от рыжей полевки и уральской мыши и 47 проб печени от домовой мыши и 23 - от восточноевропейской полевки.

При анализе хромосомных аберраций модельных видов грызунов отлов живых зверьков проводили в июле-августе 1994 года в двух поселках Красногвардейского района Оренбургской области - Старобогдановке, расположенной по осевой части ТРАС, и Кристалке, находящейся за пределами первоначальных границ следа. Домовые мыши отлавливались в жилых и административных постройках, на огородах и в окрестностях деревень; полевки были пойманы в окрестностях деревень и на их территории в зарослях кустарников и древесных насаждениях.

Всего в 1994 г. в цитогенетическом отношении изучено 47 особей домовых мышей и 23 восточноевропейских полевки. (соотношение особей в выборках было приблизительно равным). В качестве контроля использовали данные по домовым мышам из пос. Советский Тюменской области, находящегося вдали от промышленных предприятий и крупных автомагистралей, а также материалы по восточноевропейской полевке, полученные для территории Ботанического сада УрО РАН, расположенного на южной окраине г.Екатеринбурга, где уровень антропогенного загрязнения невысок (Гилева и др., 1992).

Из костного мозга животных стандартным способом были приготовлены и окрашены препараты метафазных хромосом. Наряду с обычным окрашиванием, был применен метод С-окраски для выявления структурного гетерохроматина (предобработка 5% Ва(ОH)2 в течение 5-20 минут, инкубация в буфере 2 х SSC, pH = 6,8-7,0 в течение 1-2 часов и окраска азур-эозином по Романовскому в цитратном буфере при pH = 7,0).

В метафазных клетках костного мозга учитывали хромосомные аберрации, анеуплоидию и полиплоидию, пробелы и К-митозы. Среди пойманных в Советском мышей у 55 было проанализировано по 100 метафазных клеток и у одного зверька - 50 клеток. Для грызунов из Красногвардейского района в основном анализировали не менее 50 клеток; лишь у одной мыши из Старобогдановки было просмотрено 40 клеток и у одной полевки из Кристалки - 35 клеток. В общей сложности было проанализировано 9537 клеток. К-митозы не входят в это число. При подсчете их доли за 100% принималась сумма числа проанализированных для выявления других видов нарушений клеток (50 или более) и количества клеток с К-митозами.

Для анализа выбирали метафазы округлой формы с достаточно плотным расположением хромосом, но по возможности без наложений или с минимальным количеством наложений, не препятствующих идентификации числа и состояния хромосом. Разрывы отличали от пробелов с помощью общепринятых критериев (смещение по отношению к оси хроматиды и/или наличие просвета, превышающего ширину хроматиды). При подсчете общего числа разрывов на клетку была принята "одноразрывная" модель для одиночных и парных фрагментов и "двухразрывная" модель для колец, транслокаций и инверсий.

При статистической обработке цитогенетических материалов были использованы критерий хи-квадрат, однофакторный дисперсионный анализ (в том числе, с фи-преобразованием долей), ранговый коэффициент корреляции Спирмена и G-критерий. Для попарных сравнений трех выборок с помощью G-критерия был использован метод мультипликативного неравенства Сидака (Sokal, Rohlf, 1981).

Исходя из предварительной информации об особенностях распространения радионуклидного загрязнения, в ходе полевых исследований в августе 1994 г. собраны необходимые для феногенетического анализа выборки мелких млекопитающих из четырех ключевых участков из двух районов Оренбургской области : 1 - контрольный участок - окр. дер. Нижнекристалка (расположенный в Красногвардейском районе Оренбургской области за пределами Тоцкого радиоактивного следа); имактные участки: 2 - окр. села Тоцкое Тоцкого района области (пойменный лес на левом берегу р.Самары); 3 - окр. села Кинзелька (пойменный лес р. Кинзельки); 4 - окр. села Старобогдановка Красногвардейского района области (пойменный лес р.Ток и старые лесополосы времен испытаний ядерного оружия в 1954 г.).

В июле-августе 1996 г и 1997 г материал повторно собирали в окрестностях села Тоцкое (левый берег р.Самары) и в эпицентральной зоне вблизи места взрыва - точка 2. Расположение ключевых участков сбора материала приведено на карте-схеме (рис. 4). Участок 2 у села Тоцкое (левый берег р.Самары) можно, по-видимому, отнести, судя по современной радиационной обстановке, к дополнительному контрольному. Однако, так как при ядерном взыве эта популяция исходно была расположена всего в нескольких километрах от эпицентральной зоны, следует оценивать возможный феногенетический эффект последействия также и в этой популяции наряду с участками 3 и 4, над которыми в основном и прошел радиоактивный след. Опираясь на имеющиеся в литературе и полученные нами данные, можно полагать, что основным воздействием на местную популяцию у села Тоцкое, по-видимому, было внешнее облучение в момент взрыва атомной бомбы. На участках 3 и 4 воздействие в основном определялось загрязнением радионуклидами в самые первые годы после взрыва, то есть внешним и внутренним факторами облучения.

Рис. 4. Схема размещения точек сбора рыжей полевки (Clethrionomys glareolus Schreb.) в зоне влияния Тоцкого ядерного взрыва. Пояснения см. в тексте.

Сбор материала проводился в основном в сходных пойменных лесных биотопах, расположенных в понижениях рельефа местности, где, как правило, потенциальное накопление радионуклидов наиболее существенно (Криволуцкий, 1988). Для сбора мелких млекопитающих использовали стандартный метод ловушко-линий (Формозов,1937; Кузякин,1962; Кучерук и др.,1963). На месте отлова животные подвергались комплексному биологическому анализу: определяли вид, пол, возраст, физиологическое и репродуктивное состояние. Животных взвешивали, промеряли их линейные размеры и определяли массу некоторых органов для морфофизиологического анализа (Шварц и др., 1968). Выделение функционально-возрастных групп проводили в лабораторных условиях по комплексу признаков, учитывая степень развития тимуса, вес и размеры тела, состояние генеративной системы, степень стертости жевательной поверхности зубов и стадию формирования корней у корнезубых грызунов (Кошкина,1955; Тупикова и др.,1970). На основании этих признаков у рыжей полевки, например, для каждого пола были выделены четыре функционально-возрастные группы: sen - перезимовавшие особи (отсутствие тимуса, хорошо развитая генеративная система, хорошо развитые корни зубов), ad - размножающиеся сеголетки весенней и раннелетних генераций (характерные корни зубов, наличие слаборазвитого тимуса, хорошо развитая генеративная система), sad - (отсутствие корней зубов, характерная деформация призм зуба в его основании, наличие тимуса, генеративная система на стадии близкой к половому созреванию), juv - молодые, неразмножавшиеся сеголетки (жевательная поверхность зубов еще не достигла дефинитивной конфигурации, M3 , как правило, не сформирован полностью, наличие хорошо развитого тимуса, генеративные органы не развиты). Аналогичные функционально-возрастные группы выделяли и у других видов.

Всего в 1994 и 1996-1997 гг. было отработано около 2500 ловушко-суток и в целом отловлено 1025 экз. мелких млекопитающих 10 видов, включая 549 экз. основного индикаторного вида - рыжей полевки. Полевки: рыжая - Clethrionomys glareolus, обыкновенная - Microtus arvalis, восточноевропейская (кариотипический вид-двойник обыкновенной полевки) - Microtus rossiaemeridionalis, полевка-экономка - Microtus oeconomus. Мыши: уральская (недавнее привычное название - лесная) - Apodemus uralensis (sylvaticus), полевая - - Apodemus agrarius, желтогорлая - Apodemus flavicollis, домовая - Mus musculus. Землеройки-бурозубки: обыкновенная - Sorex araneus, малая - Sorex minutus. Видовая принадлежность восточноевропейской и обыкновенной полевок определялась на основе кариотипирования на сериях зверьков, отловленных в 1994 г. под руководством д.б.н. Э.А.Гилевой.

Дополнительно была взята выборка рыжей полевки (55 экз.), отловленная А.Г.Васильевым и И.А.Васильевой в конце лета 1982 года в районе села Тоцкое в том же участке, что и позднее в 1994 г. и 1996-1997 гг. Этот материал был использован для оценки возможных феногенетических изменений в этой популяции во времени. Временной промежуток, отделяющий выборки в районе села Тоцкое в биологическом эквиваленте составляет приблизительно от 30 до 45 поколений полевок, что вполне достаточно для возникновения генетических изменений.

Черепа всех зверьков были подвергнуты специальному препарированию и подготовлены к дальнейшему их морфологическому и феногенетическому анализу. Феногенетический анализ популяций рыжей полевки исходно проводили по 53 аберрациям (фенам) неметрических пороговых признаков черепа (рис.5), которые представляют собой мелкие дискретные вариации в его строении: наличие или отсутствие определенных отверстий для прохождения кровеносных сосудов и нервов, появление дополнительных костных структур и др. Крупные аберрации (уродства) в строении черепа обнаружены в единичном числе и рассматриваются отдельно от мелких регулярных аберраций .

Рис. 5. Схема расположения аномалий строения на черепе рыжей полевки. 1-53 - номера аномалий.

Некоторые признаки были описаны нами ранее (Васильев, 1984), а многие другие, которые обнаружены впервые, гомологичны уже описанным нами и другими авторами для других видов грызунов. Отсутствие общепринятой международной латинской номенклатуры неметрических пороговых признаков черепа и их устойчивых дискретных состояний - фенов вынуждает ограничиться рабочими названиями с привлечением общепринятых латинских наименований. Нумерация фенов неметрических признаков на рисунке 5 идентична таковой в таблицах и приведенном ниже списке признаков.

С п и с о к

аберраций (фенов) неметрических признаков черепа рыжей полевки (пояснения условных обозначений приведены в тексте):

1. *

Foramen praeorbitale duplex - удвоенное предорбитальное отверстие.

2.

Вырезка лобно-носового шва на носовой кости.

3. *

Наличие дополнительного переднелобного отверстия.

4.

Переднелобное отверстие.

 

Дополнительное лобное отверстие:

5. *

впереди основного;

6.

ниже основного;

7.

позади основного;

8.

выше основного;

9.

удвоенное крупное;

10.

удвоенное мелкое.

11. *

Foramen ethmoideum duplex - удвоенное решетчатое отверстие.

12.

"Окно" в области височно-теменного шва.

13. *

"Верхнее" положение височного хода.

14.

Meatus temporale отсутствует - отсутствие височного отверстия.

15.

Meatus temporale duplex - удвоенное височное отверстие.

16.

Fenestra mastoidea - выпадение фрагмента на сосцевидной части каменистой кости.

17.

Foramen condilare - наличие отверстия в затылочном мыщелке.

18.

Foramen hypoglossi duplex - удвоенное отверстие подъязычного нерва.

19. *

Дополнительное, наружно-боковое подъязычное отверстие.

20. *

Боковое предчелюстное отверстие.

21.

Foramen maxillare I - скуловое.

22. *

Foramen maxillare II - предскуловое.

23. *

Foramen maxillare III - боковое предзубное.

24. *

Foramen maxillare IY - предзубное.

25. *

Дополнительные небные отверстия.

26. *

Fenestra palatina I - "Окно" на небной кости - переднее.

27. *

Fenestra palatina II - "Окно" на небной кости - среднее.

28.

Fenestra palatina III - "Окно" на небной кости - заднее.

29. *

Margo palatinus disjunctus - незамкнутый задний край неба.

30. *

Foramen medium на основной клиновидной кости.

31.

Окнообразное отверстие на основной клиновидной кости.

32. *

Дополнительная перегородка овального отверстия.

33.

Дополнительная продольная перемычка Foramen ovale.

34.

Переднее сопровождающее отверстие foramen ovale.

35. *

Foramen mentale duplex - удвоенное подбородочное отверстие.

36. *

Foramen mentale anterior - переднее подбородочное отверстие на дорсальной поверхности резцовой части в области диастемы.

37. *

"Предзубное" отверстие нижней челюсти.

38. *

Лингвальное "предзубное" отверстие нижней челюсти.

39. *

Удвоенное лингвальное отверстие нижней челюсти.

40.

Околорезцовое отверстие.

41.

Марка на талонусе третьего верхнего коренного зуба.

42.

Отделение талонуса третьего верхнего коренного зуба в отдельную призму

43.

Выпадение фрагмента верхней челюсти в области неба.

44.

Аномальное строение перемычек овального отверстия.

45.

Срастание теменной и чешуйчатой костей.

46.

Редукция перегородки между овальным и круглым отверстиями.

47.

Редукция височных отростков теменной кости.

48.

Крупное отверстие в центре лобной кости.

49.

Удвоенное височное отверстие.

50.

Расщепление лобной кости.

51.

Зарастание овального отверстия.

52.

Вырезка центральной части заднего края неба.

53.

Отсутствие височного отверстия.

По каждому признаку в каждой выборке подсчитывали частоты встречаемости указанных фенов отдельно на левой и правой сторонах черепа как "наличие" или "отсутствие, исходя из фактического числа наблюдений (за вычетом экземпляров, поврежденных по данному признаку). Частоты встречаемости билатеральных признаков вычисляли по отношению к общему числу изученных сторон черепа (Астауров, 1974; Hartman,1980). Вычисляли коэффициенты корреляции Спирмена между признаками, а также оценивали связь проявления фенов с полом, возрастом и размерами тела. Множественные сравнения выборок для отдельных признаков проведены с помощью G-критерия (Sokal, Rholf, 1981). Некоторые из исходно взятых признаков в ходе работы были отклонены из-за связи их встречаемости с возрастом, полом, общими размерами черепа, корреляции друг с другом (дублирование информации), редкости (1 случай обнаружения), субъективности при практической классификации (Sikorski, 1982; Sikorski, Bernstein,1984), не учитывались также механически сильно поврежденные участки черепа. В приведенном списке указаны все аберрации в строении черепа, которые были исходно обнаружены. Звездочкой помечены те из них, которые остались после предварительных оценок и тестов выбраковки. В основном по ним и проводились дальнейшие расчеты.

Для сравнения выборок по комплексу признаков проводился расчет фенетических дистанций (MMD - mean measure of divergence) методом Берри-Смита (Berry, 1963). По билатеральным признакам при оценке числа наблюдений использовано, в соответствии с рекомендациями метода число изученных сторон. Среднеквадратическое отклонение рассчитывали по формуле, предложенной Съевальдом (Sjovold,1973). Различия статистически значимы на уровне p < 0,05 при MMD > 2MSD. Введение поправки Бартлетта для нулевых значений проведено в соответствии с рекомендациями Съевальда (1973). Вычисляли показатель фенетической уникальности выборок (MU - measure of uniqueness), предложенный Берри (Berry,1963), представляющий собой сумму всех MMD, приходящихся на выборку. Ординацию матрицы фенетических дистанций проводили методом многомерного неметрического шкалирования Краскела (метод минимального стресса) с использованием пакета прикладных программ "NTSYS-pc" (Rohlf, 1988).

При оценке внутрипопуляционного фенетического разнообразия использовали два основных показателя, предложенных Л.А. Животовским (1982,1991): доля редких фенов (h) и среднее число вариаций признака ( ? ), обнаруживаемое в данной выборке. При мономорфизме ? = 1. Для популяции в целом вычисляется ? - среднее число вариаций (фенов) как среднее арифметическое от числа вариаций отдельных признаков. Показатель h позволяет оценить структуру фенетического разнообразия, а показатель ? дает оценку степени фенетического разнообразия.

Пионерные работы Б.Л.Астаурова еще в 20-е годы выявили особую форму изменчивости, которая обусловлена естественными стохастическими ошибками развития и приводит к хорошо известному теперь явлению флуктуирующей асимметрии (Soule', 1979; Захаров, 1987; Palmer, Strobeck, 1986; Parsons, 1992), Подавляющее большинство билатеральных морфометрических и неметрических признаков подвержены флуктуирующей асимметрии. Это явление неодинаковой реализации признака на разных сторонах особи обусловлено сбоями (ошибками) развития - эпигенетическими причинами, т.к. генотип особи и условия ее развития практически одинаковы для обеих сторон. Флуктуирующая асимметрия (ФА) - независимая и часто неодинаковая реализация билатеральных признаков на разных сторонах особи является обобщенной эпигенетической мерой стресса (Parsons, 1990), позволяет оценить стабильность развития группы особей и широко используется при биомониторинге популяций (Захаров, 1985, 1987; Palmer, Strobeck, 1986 и др.).

Для оценки уровня флуктуирующей асимметрии рассчитывали средний популяционный индекс флуктуирующей асимметрии FAnm как среднюю долю билатеральных асимметричных проявлений фена на признак у разных особей (Захаров, 1986; Markowski, 1993). Значимость различий между выборками по этому индексу оценивали с помощью метода непараметрической статистики Краскела-Уоллиса, который аналогичен однофакторному дисперсионному анализу.

Статистическая обработка материала включала наряду с биометрией отдельных признаков использование методов многомерного статистического анализа (факторный, кластерный анализ и неметрическое шкалирование). Все расчеты проведены на базе пакетов прикладных программ: NTSYS-pc (Version 1.40) (Rohlf, 1988), а также ECOSTAT, разработанного О.А. Жигальским, А.Г. Васильевым и О.А. Лукьяновым и "PHEN" (Version 3.0), специально разработанного А.Г. Васильевым в Институте экологии растений и животных УрО РАН для целей фенетического анализа.